GB/T 13093-2023標(biāo)準(zhǔn)歷時(shí)3年，經(jīng)過成立標(biāo)準(zhǔn)修改小組、搜集樣品、確定實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、意見征求、評(píng)審等，最終大功告成。

一、本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 13093-2006 相比，主要修訂內(nèi)容見表1：

表1：主要修訂內(nèi)容

二、主要修訂內(nèi)容實(shí)驗(yàn)分析綜述

（一）培養(yǎng)基的確定

國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)用于測(cè)定細(xì)菌總數(shù)的培養(yǎng)基是平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）和營(yíng)

養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）兩種，我們對(duì)兩種培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了比較，見表2。

國內(nèi)外測(cè)定細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，見表3。

表2 用于細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的培養(yǎng)基

表3 國內(nèi)外細(xì)菌總數(shù)測(cè)定用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間

從表2 中可以看出，PCA 里的胰蛋白胨比NA 里的蛋白胨是更優(yōu)質(zhì)的“食

物”，葡萄糖更適合細(xì)菌生長(zhǎng)。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）生長(zhǎng)的菌落不容易運(yùn)動(dòng)，不容易造成蔓延，無法計(jì)數(shù)的現(xiàn)象。

從表3 中可以看出，國內(nèi)外除了我們現(xiàn)修訂的飼料標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)保行業(yè)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)外，其余都是使用PCA 培養(yǎng)基。

兩種培養(yǎng)基相同條件下和不同條件下的比較，見表4～表5。

表4 NA 和PCA 培養(yǎng)基相同條件下的比較

表5 NA 和PCA 培養(yǎng)基不同條件下的比較

根據(jù)表4來看，在相同條件下使用NA和PCA培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)的T檢驗(yàn)分析，p=0.3917。根據(jù)這個(gè)結(jié)果可以得出結(jié)論，NA和PCA培養(yǎng)基之間的差異并不顯著。

根據(jù)表5來看，在不同條件下使用NA和PCA培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)的T檢驗(yàn)分析，p=0.9296，根據(jù)這個(gè)結(jié)果可以得出結(jié)論，NA和PCA培養(yǎng)基之間的差異并不顯著。

從以上結(jié)果可以看出，不管是方法相同和不同，差異都不顯著（p>0.05），特別是不同的檢測(cè)方法，差異更不顯著（p=0.9296）。同時(shí),在重復(fù)幾百次試驗(yàn)后，PCA 培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)更好，因平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）生長(zhǎng)的菌落不容易運(yùn)動(dòng)，不容易造成蔓延，無法計(jì)數(shù)的現(xiàn)象。

再者說，GB 4789.2-2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)的測(cè)定》、

ISO 4833-2013 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for theenumeration of microorganisms》的檢測(cè)方法，以及AOAC、FDA、AS 等方法和國內(nèi)進(jìn)出口檢驗(yàn)的方法，都是使用PCA 培養(yǎng)基。

所以，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及參考其它行業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn)，最終培養(yǎng)基修改為平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA），與國內(nèi)外接軌。

（二）培養(yǎng)溫度的確定

23 個(gè)不同種類樣品的30℃和36℃培養(yǎng)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，見表6

表6 PCA 培養(yǎng)基30℃和36℃

實(shí)驗(yàn)結(jié)果從表6中可以看出， PCA 培養(yǎng)基用30℃和36℃ 分別培養(yǎng)48 小時(shí)，70%的結(jié)果基本相同或高于30℃的結(jié)果；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在0%～2.5%之間；對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的T 檢驗(yàn)分析，p=0.1552，兩者之間差異不顯著；微生物細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度也是36℃最為適宜；

同時(shí)GB 4789.2-2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)的測(cè)定》，用36℃培養(yǎng)更加反應(yīng)樣品的菌落情況。考慮到大部分細(xì)菌（益生菌）都是用36℃溫度培養(yǎng)，省去了檢測(cè)單位培養(yǎng)箱的單獨(dú)設(shè)置和檢定。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)溫度也定為36℃。

（三）培養(yǎng)時(shí)間的確定

23 個(gè)不同種類的樣品的培養(yǎng)時(shí)間的比較，見表7。

表7 PCA 培養(yǎng)基36℃，48h 和72h 比較

兩個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的結(jié)果基本相同，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的T 檢驗(yàn)分析，

p=0.7806，兩者之間差異不顯著。同時(shí)GB 4789.2-2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)的測(cè)定》和進(jìn)出口食品、AOAC 和FDA，都是36℃，培養(yǎng)48 h，

并考慮到時(shí)長(zhǎng)和簡(jiǎn)便性。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)時(shí)間也定為48 h。

（四）細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算公式

原標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算公式是兩個(gè)稀釋度進(jìn)行比較，若比值小于2取平均數(shù)，若大于2取稀釋倍數(shù)低的�，F(xiàn)依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，計(jì)算公式中增加了修正因子，國際標(biāo)準(zhǔn)和食品標(biāo)準(zhǔn)，更加合理和準(zhǔn)確，并對(duì)不同含量和不同稀釋度可能出現(xiàn)的結(jié)果給出了實(shí)例，便于操作者使用。

細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告，增加了修約的描述，以及空白試驗(yàn)的要求。使操作者一目了然，更加合理，并規(guī)范了文本。

具體修改如下：

1.若只有一個(gè)稀釋度平板上的細(xì)菌數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板細(xì)菌數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中細(xì)菌總數(shù)結(jié)果。

上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為16000或1.6×104。

2.若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按下列公式計(jì)算：

3.若所有稀釋度的平板上細(xì)菌數(shù)均大于300 CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均細(xì)菌數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

4.若所有稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均細(xì)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

5.若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無細(xì)菌生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

6.若所有稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)均不在30 CFU～300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時(shí)，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均細(xì)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。